熱啟動(dòng)PCR（hot start PCR）概述：

在傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)中，反應(yīng)體系各成分（Taq DNA聚合酶、dNTP 和引物等）均是一次加入并進(jìn)入循環(huán)，在反應(yīng)溫度由室溫（25℃）上升至高溫（94～95℃）過程中，可能發(fā)生引物錯(cuò)配和二聚體的形成。引物與模板中一些非靶位點(diǎn)的錯(cuò)配和引物之間形成的二聚體，在Taq酶的作用下均可延伸，這些非特異性產(chǎn)物又可以在后面的PCR循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，使非特異性產(chǎn)物不斷積累，同時(shí)，也消耗反應(yīng)體系的各成分，終PCR擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物大大減少。熱啟動(dòng)PCR(hot start PCR)是指DNA聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時(shí)才發(fā)揮作用的PCR。通過這種方式控制PCR反應(yīng)的必須組分DNA聚合酶，直到反應(yīng)混合物被加熱到可以阻止非特異引導(dǎo)和引物聚合的溫度后，再啟動(dòng)PCR達(dá)到有效擴(kuò)增特異性PCR產(chǎn)物的目的。

*UNG酶通常和熱啟Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染體系的熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)系統(tǒng)。

UNG酶(Uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶)的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，從而被消除。UNG酶的佳活性溫度為50℃，95℃滅活。作用：為保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施是使用UNG酶（Uracil-N-Glycosylase）和Taq 酶熱啟動(dòng)。PCR反應(yīng)常見，重要的污染物是PCR產(chǎn)物，防污染熱啟動(dòng)PCR試劑盒以dUTP取代dTTP，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟，UNG酶即可將反應(yīng)體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性。